在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過青海發(fā)光桿菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。
轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但CaCl2 法簡(jiǎn)便易行,且其轉(zhuǎn)化效率*可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15%的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。
為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：
1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌，從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。
2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒dna應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。
3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是zui高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,分裝保存于干燥的冷暗處。
4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、dna酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。
本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化子)肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、青海發(fā)光桿菌、酶切等進(jìn)一步鑒定。
本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化子)肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。
第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑
一. 材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS質(zhì)粒DNA: 購買或?qū)嶒?yàn)室自制，eppendorf管。
二. 設(shè)備
恒溫?fù)u床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺(tái)式高速離心機(jī),無菌工作臺(tái),低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機(jī), 分光光度計(jì),微量移液槍。
三. 試劑
1.LB固體和液體培養(yǎng)基：配方見*章。
2.Amp母液：配方見*章。
3.含Amp的LB固體培養(yǎng)基:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲(chǔ)存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。
4.麥康凱培養(yǎng)基(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至*溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
第三節(jié) 操作步驟
一、 受體菌的培養(yǎng)
從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600 =0.5左右。
二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法)
1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。
4、 感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。
三、 轉(zhuǎn)化
1、從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。
2、 加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。
3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。
4、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液*被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。
同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照:
對(duì)照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。
對(duì)照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。
四、 計(jì)算轉(zhuǎn)化率
統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。
轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：
轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積
轉(zhuǎn)化頻率(轉(zhuǎn)化子數(shù)/每mg質(zhì)粒DNA)=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量(mg)
感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)=對(duì)照組2菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積/涂板菌液體積
感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)
[注意] 本實(shí)驗(yàn)方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化。但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣。有的轉(zhuǎn)化效率高，需將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉(zhuǎn)化效率低,涂板時(shí)必須將青海發(fā)光桿菌液濃縮(如離心),才能較準(zhǔn)確的計(jì)算轉(zhuǎn)化率。